Il museo ha sede dal 1990 nella chiesa di San Francesco e negli ambienti dell'annesso convento.
Costruita tra il 1335 e il 1338, la chiesa ospitò un cantiere pittorico di notevole importanza, soprattutto per la presenza di Benozzo Gozzoli, autore delle decorazioni della cappella di San Girolamo e di quelle dell'abside. Le Storie della vita di san Francesco (1452) sono tra i più importanti cicli rinascimentali conservati.
Alla decorazione delle cappelle laterali lavorarono Jacopo Vincioli, Giovanni di Corraduccio, Ascensidonio Spacca, mentre l'affresco nella controfacciata con l'Annunciazione con Eterno in gloria tra angeli e Natività è opera del 1503 di Pietro Vannucci detto il Perugino.
Dipinti, sculture, tessuti e altri oggetti provenienti dal territorio sono esposti nella galleria allestita in alcuni locali dell'ex convento. Oltre al nucleo di opere di Francesco Melanzio di Montefalco, la pinacoteca espone affreschi staccati e lavori della cerchia dell'Alunno e di Antoniazzo Romano. Nella cripta sono visibili reperti archeologici e frammenti lapidei di varie epoche.
È possibile visitare anche le antiche cantine del convento francescano, mirabile testimonianza di un legame sempre vivo tra Montefalco e il suo vino autoctono.